2018/11/2 15:43:53 阅读(44)

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase ）活性酶耦联光度法定量检测试剂盒

产品说明书（中文版）

主要用途

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase）活性酶耦联光度法定量检测试剂是一种旨在通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和苹果酸脱氢酶偶联反应系统中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应，即采用光度法测定其氧化后吸光峰值的变化，以分析植物裂解样品中 PEPCase 活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种植物组织，包括种子（seed）、叶片（leaf）、根（root）、胚胎叶（cotyledon）、上胚轴（epicotyl）等、部分或完全纯化酶样品中 PEPCase 的定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。

技术背景

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate Carboxylase；PEPCase；EC4.1.1.31），属于羧基裂解酶（carboxylyase）家属成员之一，同源四聚体，单体110Kd，广泛存在于植物、原生生物（protist）和细菌里，位于胞浆，催化碳酸氢固定（bicarbonate fixation）到磷酸烯醇式丙酮酸，产生四碳化合物草酰乙酸，释放磷酸根的反应。在四碳（C4）和景天酸代谢（crassulacean acid metabolism；CAM）等陆生植物（terrestrialplant）中，例如玉米等，其具有催化光合成碳同化作用（assimilation）和有机酸代谢，控制 -羧基化（ -carboxylation）的效率，产生NADPH，调节pH和电中性（electroneutrality），生成苹果酸以及酵解，重新捕获呼吸产生的二氧化碳等功能；在三碳（C3）或非光合成和四碳类植物中，例如水稻和小麦等，其参与回补反应（anaplerotic），为KREBS循环提供中间产物，并且提供碳类支持氨基酸合成，尤其在植物发育和种子发芽时期，调节碳和氮代谢相互作用?；诘孜锪姿嵯┐际奖?，在二氧化碳的存在下，受到磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的作用，获得产物草酸乙酰（oxaloacetate），进而通过苹果酸脱氢酶（malate dehydrogenase；MDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的变化（340nm），来定量分析磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性。其反应方式为：

产品内容

清理液（ReagentA） 毫升

裂解液（Reagent B） 毫升

缓冲液（Reagent C） 毫升

酶促液（Reagent D） 微升

反应液（Reagent E） 微升

底物液（Reagent F） 微升

阴性液（Reagent G） 微升

产品说明书 1 份

保存方式保存清理液（ReagentA）在 4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，避免光照和反复冻融；有效保证 6月

用户自备

1.5 毫升离心管：用于样品保存的容器

15 毫升锥形离心管：用于样品处理的容器

DOUNCE 匀浆器：用于裂解组织细胞

（微型）台式离心机：用于样品预处理

200 微升 1 厘米光径比色皿或 96 孔板：用于光度分析操作的容器

分光光度仪或酶标仪：用于样品光度分析

实验步骤

一、 待测样品准备

1． 准备好新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等），并秤重以确定 1 克组织重量

2． （选择步骤）放进预冷的 15 毫升锥形离心管

3． （选择步骤）加入 xx 毫升 清理液（Reagent A ）清洗 1 次

4． 即刻用刀片切碎组织

5． 放进一个预冷的 15 毫升锥形离心管

6． 加入预冷的 xx 毫升 裂解液 （Reagent B ）

7． 涡旋震荡 5 秒，充分混匀

8． 即刻放进预冷的 DOUNCE 匀浆器，在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约 80 下）

9． 将所有组织匀浆物移入 1.5 毫升离心管，放进 4℃微型台式离心机离心 10 分钟，速度为 10000g

10．小心移出上清液（注意： 不要触碰沉淀物 ）到 1.5 毫升离心管

11．移取 10 微升进行蛋白定量检测（注意： 建议使用 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－ GMS30030.1）

12．放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用

二、 测定准备

1． 准备好待测样品（例如植物裂解悬液等），置于冰槽里

2． 设定好分光光度仪（温度为 30℃）：波长为 340nm，间隔 1 分钟，读数 6 次（共 5 分钟），并置零

3． 缓冲液（Reagent C ）室温下均衡温度

三、 背景对照测定

1． 移取 xx 微升 缓冲液（Reagent C ）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升 酶促液（Reagent D ）

3． 加入 xx 微升 反应液（Reagent E ）

4． 加入 xx 微升 底物液（Reagent F ）

5． 放进 30℃培养箱里静置 3 分钟

6． 加入 xx 微升 阴性液（Reagent G ）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）8． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340 波长读数 0 分钟 －340 波长读数 5 分钟

四、 样品测定

1． 移取 xx 微升 缓冲液（Reagent C ）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升 酶促液（Reagent D ）

3． 加入 xx 微升 反应液（Reagent E ）

4． 加入 xx 微升 底物液（Reagent F ）

5． 放进 30℃培养箱里静置 3 分钟

6． 加入 10 微升待测样品（注意：50 微克植物裂解蛋白；样品须溶解 ）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340 波长读数 0 分钟 －340 波长读数 5 分钟

五、 计算样品活性

六、 酶标仪 测定

1． 在 96 孔板上做好相应标记：背景对照和样品

2． 分别移取 xx 微升 缓冲液（Reagent C ）到 96 孔板里

3． 分别加入 xx 微升 酶促液（Reagent D ）

4． 分别加入 xx 微升 反应液（Reagent E ）

5． 分别加入 xx 微升 底物液（Reagent F ）

6． 轻轻摇动 96 孔板

7． 在 30℃温度下孵育 3 分钟

8． 分别加入 xx 微升 阴性液（Reagent G ）或待测样品（50 微克植物裂解悬液蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈 ）

9． 轻轻摇动 96 孔板

10．即刻放进酶标仪检测：0 分钟读数和 5 分钟读数

11．活性计算：

注意事项

1． 本产品为 20 次操作，包括背景操作

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，背景测定只需 1 次

4． 样品处理忌用磷酸缓冲溶液

5． 样品须澄清，至关重要

6． 加入样品启动反应后 3 秒内即刻光度测定

7． 测定值由高到低变化；测定可持续 30 分钟

8． 光度测定后，比色皿须清洗彻底

9． 样本测定 0 分钟读数高于 5 分钟读数表明具有酶活性

10．建议待测样本蛋白浓度为 50 微克/10 微升（本公司提供 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）

11．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

12．磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性单位浓度定义：在 30℃温度下，pH 8.0 条件下，每分钟内能够氧化 1 微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位

13．本公司提供系列羧化酶检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测敏感

使用承诺

秉着 信誉至上、客户满意、质量承诺 的宗旨为我们的用户提供产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后 10 天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒

IF IT DOESN T WORK， ， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHATYOU DID WRONG 。

订购信息

单组分订购信息

编号 名称 规格

GMS16017 植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性酶耦联光度法定量检测试剂盒 20 次

GMS16017A 清理液（ReagentA） 毫升

GMS16017B 裂解液（Reagent B） 毫升

GMS16017C 缓冲液（Reagent C） 毫升

GMS16017D 酶促液（Reagent D） 毫升

GMS16017E 反应液（Reagent E） 毫升

GMS16017F 底物液（Reagent F） 毫升

GMS16017G 阴性液（Reagent G） 毫升