实验材料：

Mouse, Rabbit 或Goat IgG TrueBlot

TrueBlot Ig IP 微球 or Protein A 或 G 微球

实验设备：

SDS-PAGE电泳及转膜相关设备和缓冲液；

微量移液器；

摇床；

PVDF或nitrocellulose膜；

WB结果检测设备及底物

实验步骤

1）. 免疫共沉淀（IP）和SDS-PAGE电泳

(1) 细胞裂解：往107/ml细胞中加入适量预冷的细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，混匀4度孵育30-60分钟后10000g离心15min，保留上清液。布氏法检测蛋白浓度后，将样品稀释为1 g/ l左右?？?80度冻存或继续下一步。

(2) 细胞裂解物的预清洗：加50ul之前用裂解液稀释的相应种属Ig IP Beads（or Protein A/G beads）到装有500ul细胞裂解物的离心管中，冰上孵育30-60分钟；2500 g离心2-3分钟后把上清液（不能带沉淀微球）转移到新的离心管中。

(3) 免疫共沉淀：在装有预清洗后的细胞裂解物的离心管中加入1-10ug的一抗，4 C孵育 1-2小时或者摇晃过夜。再加入50ul用裂解液预处理过的Ig IP Beads（or Protein A/G beads），4 C混匀孵育1-2小时或摇床过夜后2500 g离心0.5分钟（可以和一抗一起孵育）。尽量完全地移去上清液并用500ul预冷的裂解液洗涤3次（每次都要离心弃完上清，有利于降低背景）。

(4) zui后一次洗涤并小心的吸掉上清液后，加入50ul 1X Laemmli sample buffer（或含50mM DTT的SDS Sample Loading Buffer）（注意Sample Loading Buffer成分必须含有还原剂）。Vortex混匀后加热至90-100℃，10分钟。10000 g离心5分钟，小心收集上清。10-30ul上样电泳，避免上样Beads。

注：收集的上清液可以置于-20 C保存。用时解冻后，加入新鲜的DTT并加热至90-100℃十分钟。10000 g离心5分钟，收集上清进行上样电泳。

2）. 免疫印迹（Western Blotting）

(1) 如前所述SDS-PAGE电泳结束。

(2) 把蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至NC膜上。丽春红-S染色鉴定是否转膜成功，考马斯亮蓝对SDS-PAGE进行染色分析转膜效率，蒸馏水或TBST清洗丽春红。

(3) 在通风柜里，将NC膜在True Blot enhancer buffer 浸泡2min，TBST清洗一次。

(4) 将NC膜浸入5%的脱脂奶粉的封闭液中，置于摇床上室温封闭2小时。

(5) 弃去封闭液后，加入靶蛋白一抗（用5%脱脂奶粉封闭液稀释，终浓度需要预实验摸索，建议1-2ug/ml）。置于摇床上室温孵育2小时或者4℃孵育过夜。

(6) 用TBST洗涤膜4-5次，每次5-10分钟。

(7) 弃去洗液后加入适量的用5%脱脂奶粉封闭液稀释好的TrueBlot （稀释比为1：1000），室温孵育1小时。

(8) 用PBST或TBST洗涤膜4-5次，每次5-10分钟。

(9) 用合适的过氧化物酶HRP化学发光底物并按照说明（等量的底物A+底物B）进行显色反应。

(10) 在暗室中用X光片曝光，根据结果调整曝光时间（10sec、1min、5min和20min）和曝光区域,以得到zui佳效果。

3）. 注意事项

(1) 免疫共沉淀抗体的稀释：用于免疫共沉淀的抗体在使用之前需要进行稀释，例如使用浓度为1-5ug/107细胞/ml。一般对于从107细胞裂解出的大部分蛋白抗原来说，加入2ug抗体就足够了。因为尽量减少抗体用量可以降低还原性沉淀抗体对SDS-PAGE电泳样品检测的干扰。（TrueBlot 并不能增强免疫印迹中抗体和抗原之间的特异性结合，所以如果用于WB的抗体能与非目的蛋白产生交叉反应，结果也会被TrueBlot 检测出来）

(2) WB的封闭：Mouse, Rabbit 和Goat IgG TrueBlot 检测过程中的膜封闭，一抗稀释孵育和TrueBlot 稀释孵育过程都建议使用5%（w/v）的脱脂奶粉液。BSA不建议使用于此过程。

(3) 阳性对照：Mouse, Rabbit 和Goat IgG TrueBlot 检测SDS-denatured, non-reduced mouse IgG，所以可用20ng non-reduced沉淀抗体直接上样电泳，然后WB作为IgG TrueBlot 的阳性对照。

(4) 阴性对照：WB过程中不加一抗，直接加二抗TrueBlot beads。

(5) SDS-PAGE电泳及WB：Mouse, Rabbit 和Goat IgG TrueBlot 检测过程为用含适量抗氧化剂上样液电泳，然后Poncean S预染和20%的乙酸/30%甲醇脱色；再室温自然晾干1小时，用含甲醇的Buffer A润膜后封闭。这个操作过程可以得到很好的WB结果，PVDF膜或硝酸纤维膜都适用于此检测过程。

4）.相关缓冲液配方：

2X SDS Reducing Sample Loading Buffer (包含50 mM DTT)

950 mL 2X SDS sample buffer

50 mL 1M DTT

注: 1小时内使用，过期丢弃。.

2X SDS Sample Buffer

6% SDS

25mM Tris base pHed to 6.5 with HCl

10% glycerol

Bromphenol blue

注: -20 C长时间储存 ，室温zui多只能储存一月。

TBS-Tween (TBS-T):

25 mM Tris-HCl, pH 8.0

125 mM NaCl

0.1% Tween 20

Blocking Buffer:

5g 脱脂奶粉

100ml TBS-T

调整PH值为7.4

Antibody Binding Buffer:

含1% 脱脂奶粉 TBS-T

Protease Inhibitor Cocktail (100X):

PMSF, 5mg (50 g/ml)

Aprotinin, 100 g (1 g/ml)

Leupeptin, 100 g (1 g/ml)

Pepstatin, 100 g (1 g/ml)

Phosphatase Inhibitor (100X):

1mM Na3VO4

1mM NaF

注： IP: Immunoprecitaton免疫共沉淀. WB: Western Blot蛋白质印记

参考文献：

1. Alegria-Schaffer A, Lodge A, Vattem K. 2009. Performing and optimizing Western blots with an emphasis on chemiluminescent detection. Methods Enzymol. 2009;463:573-99.

2. Haan C, Behrmann I. 2007. A cost effective non-commercial ECL-solution for Western blot detections yielding strong signals and low background. J Immunol Methods. Jan 10;318(1-2):11-9.

3. Immunoblot affinity purification. 2005. Nature Methods 2, 797 798.

4. Uhlig U, Uhlig S, Branscheid D, Zabel P, Vollmer E, Goldmann T. 2004. HOPE technique enables Western blot analysis from paraffin-embedded tissues. Pathol Res Pract. 2004;200(6):469-72.

5. Wu M, Stockley PG, Martin WJ 2nd. 2002. An improved western blotting technique effectively reduces background. Electrophoresis. Aug;23(15):2373-6.

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