双光子吸收/激发技术的原理：在强光激发下，分子同时吸收两个光子，从基态跃迁到两倍光子能量的激发态的过程。两个光子可以是相同波长的，也可以是不同波长的，但必须是同时吸收（两个光子到达被激发分子的时间间隔小于1飞秒）?？梢哉庋斫?，先吸收一个光子的能量跃迁到一个虚拟的中间态，然后再吸收一个光子的能量跃迁到激发态。 双光子显微镜相对于共聚焦等其他显微镜的优点： ~ 光损伤?。河捎谒庾酉晕⒕凳褂玫氖强杉饣蚪焱夤庾魑し⒐庠?，这一波段的光对活体细胞和组织的光损伤小，适用于长时间的研究； ~ 穿透能力强：相对于紫外光，可见光和近红外光都具有更强的穿透能力，因而受生物组织散射的影响更小，解决对生物组织中深层物质的层析成像研究问题；研究表明，共聚焦荧光成像的成像深度一般在50微米左右，而双光子显微镜的成像深度可达1000微米； ~ 高分辨率：由于双光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的区域内可以激发出荧光，双光子吸收仅局限于焦点处的体积约为波长3次方的范围内

在体可倾斜双光子显微成像系统 双光子显微成像系统的原理 双光子显微成像系统如何实现 红外激光?秒级脉冲要求 IV级别； 可调钛：蓝宝?光源； ?光?到达焦点同步性； 能量叠加在焦点激发荧光； 光?能量?以在焦点激发?个荧光事件； 要求必须在?个?常?的样本区域激发染料； ?分辨率； 激发和发射都需要?分辨率 ， 因为我们要激发?个?常?的点，我们必须保持移动的点，以激发整个样品，这是 ?次扫描，我们使?电动旋转反射移动这?点，?个移动的位置在X（左/右）和? 个移动位置在Y（向上/向下） 下?的图?显?了?个简化的相机传感器，每个圆圈是?个敏感的像素 当??个相机成像时，光是从样品上的?个单独的像素位点到达传感器的， 传感器同时能读取这个像素位点的信息 但是PMT不同于相机成像，它是?个光敏感像素，并且它能分辨出光量多少 我们需要将样品分成更多的??积区域，PMT逐?读取每个?区域?的光信息，即我们 通常所说的像素 PMT读取顺序 软件将PMT采集到的这些信息重新组建成类似于?赛克?样的图?，我们可以很清 晰的还原图像。 双光子显微成像系统的用途 在较厚的?物样品中采集到较薄的光学切?荧光图像； 在体双光?荧光成像，可在活体动物组织上实现超过300微?的成像深度，观察感兴趣神经细 胞的快速3D动态变化； 对于需要超?镜下空间的实验动物更有优势，?如清醒?动物实验平台； 在体可倾斜 双光?成像物镜可在三维平?内做任意?度的倾斜，以适应不同样品不同成像 区域的需求； 双光?成像系统可为在体电?理记录提供图像信息，实现对特定?标神经元的纪录； 可以与电?理记录、动物?为测量系统相互触发，实现同步纪录； 双光子显微成像系统的成像特点 在体可倾斜 双光?成像物镜可在三维平?内做 任意?度的倾斜，以适应不同样品不同成像区域的 需求 三维深层扫描 扫描深度可达900微? 只激发焦点区域，光毒性? 信噪??，图像清晰度? 1. 任意?度在体双光?显微成像系统是?套采??功率超快?秒脉冲激光器作为激 发光源、在较厚的?物样品中采集到较薄的光学切?荧光图像的显微镜设备； 2. 主要应?于在体双光?荧光成像，可在活体动物组织上实现超过300微?的成像深 度，观察感兴趣神经细胞的快速3D动态变化； 3. 对于需要超?镜下空间的实验动物更有优势，?如清醒?动物实验平台。双光? 成像物镜可在三维平?内做任意?度的在体图像，以适应不同样品不同成像区域 的需求。 双光子显微成像系统能解决的问题 购买双光子显微成像系统的必要性 1. 在体研究的必要性： 味觉，视觉，嗅觉，听觉，触觉是动物所能接受的所有外部刺激，?脑就是依靠这五种 感官的输?来认知、学习与记忆整个外部世界的。?前来说,科研从in vitro到in vivo，多数in vivo实验是在?醉动物上实现的，如何对freely moving animal进?研究成了科研难点。?相 对于?醉状态下的动物来说, freely moving animal的动物才是?命最真实的状态,在freely moving animal上的实验所得到的数据也才是最可靠的数据。 购买双光子显微成像系统的必要性 2. ?前科研研究现状： 我们在研究脑功能时,通最常?的?法就是神经电?理的?法,?如我们想知道?脑某些特 定的区域或者特定的细胞,执?什么功能,?先要设置?个合理的任务,研究动物的?为，?如 旷场试验,?迷宫实验,?架迷宫实验,同时我们会定量记录?脑的电?理的活动,从?看?脑的 电?理活动与这个任务是如何相关的,也就是说对?脑的电?理活动与动物?为学进?相关性 分析,那我们就可以知道,动物在做某些特定?为的时候,?脑哪些细胞在放电,哪些脑区会有反 应.这是?较典型的做法。由于?前在体电?理?多数是采?盲插的?式，我们看不到细胞的 具体形态，如果与双光?技术结合，我们就既可以看到细胞的放电活动，?可以观察细胞在 形态学上的特征，从?更好的研究神经细胞的功能及其特点。 双光子显微成像系统在我平台的应用 1. 主要应?于清醒?动物在体荧光（结构与钙离?功能）成像，可以与本课题组??开发搭建的虚拟现实?为学 平台相结合，实现在实验动物的?为学习过程中，对其神经环路的功能和形态的变化进??期观察（chronic imaging）； 2. 该系统与膜?钳系统结合，实现双光?成像引导下的?标膜?钳记录（two-photon microscopy guided targeted patch-clamp recordings）,可以将功能成像的群体记录（population recordings）与单细胞阈值下的膜电位 （single-cell subthreshold membrane potential recordings）相结合，揭?神经?络的活性是如何决定?络中单 个神经元的表征的； 3. 该系统还配备了单细胞电穿仪（single-cell electroporator）,可以在双光?显微成像的引导下，使?电转导将外 源基因导?对活体动物体内的指定单个细胞内，通过干涉单个细胞的基因表达，并且跟踪观察其结构和功能的 变化，以及它对局部神经?络的影响，研究特定细胞在?为学习、?络调控、甚?是病程发展中的变化和作?； 4. 与学院已建?的神经分?与细胞?物学的研究平台相结合，将进?步拓展研究?段和研究范围，形成从分?细 胞层?，到神经环路结构功能，直?整体动物?为与功能的全?位研究体系； 实验平台需要满足的条件 1.适合在体动物实验?的固定载物台式正置显微镜：电动Z轴，精度≦20nm，调焦?程 25mm；电动XY轴，精度 ≦20nm，XY移动整体在体实验平台，?程 50mm； 2. 扫描成像模式：共振扫描与检流计扫描混合的?式。能实现512x512像素分辨率下 28帧/秒的成像速度； 3.双通道PMT检测模块。两个通道均配置?灵敏度GaAsP PMT检测器，检测?？榘琁R阻挡滤镜、红绿发射荧光分 光滤?镜组。为提?检测效率，检测器需紧靠物镜，并且调焦时物镜与检测器的相对位置不变； 4.成像物镜可在三维平?内做任意?度的倾斜，为保证成像稳定性，物镜倾斜时需保持显微镜机?不移动。从物镜到 光学平台的?度 30厘?，满?在体清醒动物双光?实验； 5.带有压电陶瓷型?速物镜Z轴扫描单元，Z轴步进?程 400 微??？膳浜?速XY扫描振镜，实现?速三维Volume Scan； 6.进显微镜光路之前，激光光路中需配有普克尔盒，可实现在690 - 1020nm范围内?速调节激光输出功率的能?， 且可配合?速XY振镜使?；光路中还需配有全挡光机械快?、以及功率计（实时检测激光功率）； 7. 激光器峰值功率： 425 kW at 800nm 56 kW at 690 nm 217 kW at 710 nm 217 kW at 920 nm 34 kW at 1040 nm 将要购买的双光子显微成像系统的优点 1. 使?共振（resonant）扫描系统具有更快的扫描速度（30帧/秒），这是传统的振镜（galvo）扫描系 统双光?扫描显微镜扫描速度的8-10倍； 2. 更快地扫描速率使我们能?更短的间内完成所需要的重复记录，从?缩短单次记录（a single recording section）的时间； 3. 配备更加灵敏的光电探测器 磷砷化镓光电倍增管（Gallium arsenide phosphide (GaAsP) PMT）， 与传统的光电倍增管（PMT）相?，对光信号的敏感度和增益提?3-6倍，能?幅提?系统的信噪?， 更重要的是让我们能够对光信号更弱的结构进??速成像，?如更深的?脑?层（Layer 4， Layer 5 和 Layer 6）和亚细胞结构（树突突起和轴突的末端）； 4. 配备的激光发?器系统具有更窄脉冲宽度（ 70 fs）的和?散补偿系统，这将?幅增强双光?的激发 效率（excitation efficiency）。在?时间（2?时）的在体成像过程中，为了避免?强度激光造成的组织 损伤，?于成像的激光强度必须控制在较低的?平(20-40毫?)； 5. 成像物镜可在三维平?内做任意?度的倾斜，这使我们可以在保持动物头部固定向上的姿势的同时， 对不在?平?上的脑区成像。这对清醒动物的研究很重要，因为让动物保持相对正常的姿势，对于探索 正常的?为学习，有很?的影响

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